光学投影层析成像

光学投影层析成像（Optical Projection Tomography, OPT）是一种用于对厘米级尺度、半透明生物样本（如小鼠胚胎、器官或类器官）进行三维结构成像的技术。它填补了传统显微镜（成像尺寸小、穿透深度有限）与宏观医学影像（如CT、MRI，分辨率相对较低）之间的空白。

第一步：基本原理与光学设定
OPT的工作原理类似于X射线计算机断层扫描（CT），但使用的是可见光而非X射线。其核心是投影重建：当一个半透明的样本在光束中旋转时，相机从不同角度拍摄其二维投影图像，随后通过反投影等重建算法，计算出样本内部结构的二维三维分布。样本通常需要被包裹在折射率匹配的凝胶或溶液中，以减少光线在样本表面发生的散射和折射，从而确保投影图像的清晰度。

第二步：成像模式——透射式与荧光式
OPT主要有两种成像模式：

1. 透射式OPT：使用宽场白光或单色光从一侧照射样本，在对侧用相机接收透射光。其成像对比度主要来源于样本内部不同组织对光吸收的差异（例如，血红蛋白对特定波长的强吸收），因此擅长再现解剖结构，如器官轮廓、血管网络和骨骼（经特殊染色后）。
2. 荧光式OPT：使用特定波长的激发光照射样本，激发其内源性（如自发荧光）或外源性（如GFP标记、免疫荧光染色）的荧光物质，然后相机通过滤光片收集发射的荧光信号。此模式能对特定的基因表达、蛋白质分布或细胞群进行高对比度、特异性的三维定位。

第三步：样本制备与光学澄清
样本制备是OPT成功的关键。典型的流程包括：

• 固定：使用多聚甲醛等固定剂保持样本形态。
• 脱水与渗透：将样本逐步置于梯度浓度的有机溶剂（如甲醇）中脱水。
• 光学澄清：将样本浸入折射率匹配液（如苯甲醇/苯甲酸苄酯混合物）中。此步骤至关重要，它能显著减少组织内部的光散射，使样本变得透明或半透明，光线得以直线穿透，从而获得清晰的投影图像。

第四步：数据采集与三维重建
将澄清后的样本置于一个充满匹配液的旋转成像室中。在计算机控制下，样本绕其长轴精确旋转（通常每旋转0.9°或1°拍摄一帧），在每一个角度下，相机采集一张二维投影图像。采集完所有角度（通常为400张）后，使用类似CT重建的算法（如滤波反投影算法或迭代重建算法）处理这组二维投影序列，最终生成一个由众多体素构成的三维数据体。这个数据体可以从任意角度进行切片、渲染和量化分析。

第五步：技术优势与典型应用
OPT的优势在于：

• 分辨率与尺度的平衡：典型分辨率为10-50微米，足以分辨单个胰岛、脑区或肢芽，成像范围可达1-15立方厘米。
• 多通道荧光成像：可依次使用不同激发/发射滤光片组，对多个荧光标记同时成像，实现多目标共定位。
• 定量分析：可对三维空间中的结构体积、荧光信号强度进行精确测量。

其典型应用包括：

• 发育生物学：对完整小鼠胚胎进行高分辨三维形态发生研究。
• 肿瘤学：对小型肿瘤模型或转移灶进行三维可视化。
• 神经科学：观察全脑的基因表达模式或神经投射。
• 器官生物学：对分离的胰腺、肺或淋巴结等器官进行结构分析。

第六步：局限性与发展
OPT的局限性主要源于其对光学的依赖：

• 样本要求：只适用于经过特殊澄清处理、厚度适中的离体样本，无法用于活体成像。
• 穿透深度限制：尽管进行了澄清，光在组织中的穿透和吸收仍限制了可成像的样本大小和内部结构的可见度。
• 散射影响：残余散射会降低图像分辨率和对比度。

其发展方向包括与更高分辨率的显微镜技术（如光片显微镜）结合形成多尺度成像平台，开发更高效的澄清方法，以及应用更先进的重建算法来提升图像质量。